半岛体育官方网站登录入口科研丨浙工大： 植物早期在根际选择抗生素耐药基因组(国人佳作)

　　综上所述，本研究发现植物根际耐药基因组受植物宿主诱导的定向选择的影响。此外，植物根际的大部分ARGs(约60%)在植物传代培育过程中富集，并与植物招募的有益根际细菌显著相关。

　　了解抗生素耐药基因(ARGs)在植物根际的传播和出现，对于评估现代ARGs在土壤地球健康中的风险至关重要。然而，人们对植物根际的选择机制知之甚少。本研究首先分析了拟南芥根际微生物组三代富集过程中根际抗生素耐药基因组的动态变化，发现植物定向富集具有多种ARGs的有益功能细菌。利用宏基因组技术评估了四种常见作物(大麦、籼稻、粳稻和小麦)中耐药基因半岛体育官方网站登录入口组的富集潜力，发现小麦根际含有更丰富的ARGs。因此，最终对小麦根际微生物组进行了三代培育，发现约60%的ARGs与小麦根际富集的有益细菌有关，这些细菌可能进入土壤食物网并威胁人类健康，尽管它们在植物根际也发挥着有益的功能。本研究为ARGs在植物根际的传播提供了新的见解，所获得的数据可能有利于农业可持续发展和生态安全。

　　拟南芥根际的所有样品共检测到119个ARGs和5个可移动遗传元件(MGEs)。根据检测到的ARGs分为9类(氨基糖苷类、β-内酰胺类、大环内酯-林可酰胺-链阳霉素B(MLSB)、多药耐药、磺胺类、四环素类、氯霉素、万古霉素和其他)。其中，多药耐药基因、氨基糖苷类和四环素耐药基因是最主要的类别。这些ARGs的耐药机制主要包括抗生素失活(41%)、外排泵(37%)、细胞保护(18%)和未知(4%)。连续栽培几代拟南芥的土壤悬浮液富集后，根际土壤中ARGs和MGEs的数量显著高于自然土壤(NS)，而不同栽培周期的样品中这些数量没有明显变化(图1a)，表明根际可能是ARGs富集的一个重要微域。随着培育周期的增加，耐药基因组的多样性指标(Shannon和Simpson指数)逐渐下降，表明部分ARGs水平逐渐降低。

　　为了确定样本中ARGs组成变化的关键驱动因素，我们使用了基于Bray-Curtis距离的PCoA分析(图1b)。第一主坐标(PCo1)从G1、G2和G3(ANOSIM，P=0.002，R2=0.69)中显著分离出NS，表明拟南芥对耐药基因组的根际效应。随着第二主坐标(PCo2)的加入，三代的模式相互分离，G1和G3之间存在显著差异(ANOSIM，P=0.002，R2=0.69)，表明宿主多代培育过程中耐药基因组发生了变化。为了确定在培育周期中变化显著的ARGs，我们选择了在75%的样本中均存在的10个最丰富的ARGs。部分ARGs(如磺胺耐药基因sul2、多药耐药基因oprD和ttgB、氨基糖苷类耐药基因aphA1、β内酰胺酶耐药基因blaCMY2和blaCMY)在G1土壤样品中含量较低，但随着培育周期的增加而增加，在G3中显著富集(图1c)。为了确定ARG水平的动态变化，我们使用了基于ARG组成的中性群落模型(NCM)(图1d)。该模型在所有样本中表现出极弱的拟合优度(R2 =0.021)和元群落中极少的迁移(Nm=12)，表明ARG在根际的积累不是一个随机过程，而是由宿主决定的重要的定向选择。

　　a. 来自Natural soil (NS，自然土壤)和根际土壤的ARGs和MGEs总数(G1、G2和G3，G表示世代)。b. 采用基于ARGs和MGEs相对丰度的Bray-Curtis距离进行主坐标分析(PCoA)，以解释NS、G1、G2和G3中ARGs和MGEs分布模式的差异。c. 显示根际土壤中10个最丰富和最常见的ARGs(≥75%)的变化趋势的热图。这些ARGs的相对丰度随着培育周期的增加而增加。d. 中性群落模型拟合了不同ARGs的出现频率与根际土壤平均相对丰度的函数关系。e. 根际微生物群(属水平)与耐药基因组之间的关系。普通最小二乘线性回归显示了相关ARGs的数量与群落指标(度、negative degree、接近中心性和hub)之间的关系。

　　基于拟南芥16S rRNA基因扩增子测序结果，使用PCoA分析发现PCo1将NS与G1、G2和G3显著分离(ANOSIM，P=0.001)。我们进一步测定了拟南芥根际微生物组的组成，发现在属水平上前10个最丰富的属中有8个(其中假单胞菌Pseudomonas、根瘤菌Rhizobium和黄杆菌Flavobacterium)(频率75%)在培育周期中逐渐富集。经过一个培育周期后，根际微生物群落中Methylotenera消失，鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)随着培育周期的增加而逐渐减少。主要属在整个培育周期的梯度结果表明，宿主对根际微生物表现出很强的选择性。Mantel检验(R2=0.74，P=0.01)和Procrustes分析(∑M2=0.16，r=0.91，P0.001，9999 permutations)表现出拟合优度。同时，普通最小二乘(OLS)线性回归模型也显示出MGEs丰度与ARGs组成之间存在很强的相关性(R2=0.52，P0.001)。这些结果表明，根际细菌群落和MGEs的变化可能是植物传代培育周期中抗生素耐药基因组形成的主要驱动因素。因此，我们选择了在拟南芥根际G3中显著富集的前30个属。基于耐药基因组和微生物组相对丰度的共现网络表明，大多数ARGs水平(60%)与受植物诱导选择强烈影响的富集微生物组呈显著正相关(图1e)。此外，度、负度、接近中心性和hub等微生物群落指标与相关ARGs的数量呈显著正相关。

　　在拟南芥根际，基于丰度、频率、度、负度，接近中心性和hub指标对群落中各细菌的功能重要性进行了量化，发现功能重要性高的细菌(如假单胞菌、黄杆菌、芽孢杆菌、Ensifer和Massili)属于“富集微生物组”(图2a)。一般来说，根际微生物组与植物免疫相关，并诱导宿主对致病菌产生被动抗性。为了确定拟南芥选择各种微生物功能的策略，我们使用Tax4Fun2预测了根际细菌功能属性随着培育周期的增加而发生的动态变化。图2b中的热图显示了G1-G3组中发生显著变化的前20条KEGG代谢通路。这些途径包括氨基酸代谢(30%)、碳水化合物代谢(25%)、辅因子和维生素代谢(20%)、核苷酸代谢(10%)、能量代谢(5%)、脂质代谢(5%)和聚糖生物合成和代谢(5%)(图2c)。上述KEGG途径在G2和G3培育组样品中的富集程度均高于G1组，表明在多代培育过程中根际微生物的功能富集。此外，在G2和G3培育组的样品中，与多种抗生素生物合成途径相关的基因的富集量大于G1组(图2d)。特别是，这些基因影响了万古霉素类抗生素、青霉素、头孢菌素、新霉素、卡那霉素、庆大霉素和链霉素的合成，链霉素是一种氨基糖苷类抗生素，在所有样品中含量最高，且在培育周期中呈显著逐渐富集的趋势。这些结果表明，在没有任何外源压力的情况下，植物会影响功能细菌的组成，而功能细菌中含有大部分的ARGs。

　　a 每个细菌的重要性值(包括丰度、频率和某些群落指标)的直方图。b 从G1、G2、G3根际样品中提取的微生物KEGG 3级代谢途径差异的热图。c G1-G3组中KEGG 2级通路的比例发生显著改变。d G1-G3培育组根际样品中抗生素生物合成途径相关基因的富集。d 数据以平均值±标准误差表示(n = 4)。不同培育组土壤样品间差异的统计学显著性表示为*P 0.05、**P 0.01、***P0.001。

　　首先使用宏基因组测序测定大麦、籼稻、粳稻和小麦这四种代表性作物的耐药基因组谱(图3a)。小麦根际耐药基因组的丰富度和Shannon多样性最高。基于Bray-Curtis差异的PCoA分析结果显示，相比于与其他作物的耐药基因半岛体育官方网站登录入口组的差异，小麦根际耐药基因组组成与非根际土壤的差异更大。这一发现表明，小麦根际的ARGs比其他作物的ARGs要丰富得多(图3a)。在这些作物根际耐药基因组共享的ARGs中，多药、杆菌肽和大环内酯-林可酰胺-链阳霉素耐药基因最为丰富。然而，尽管不同的作物共享大量土壤衍生的ARGs，但它们深刻影响不同的根际耐药基因组。除了多药耐药基因在各作物的根际耐药基因组中占主导地位外，不同植物的根际耐药基因组中均富集了不同的ARGs。例如，小麦根际β-内酰胺抗性基因的相对丰度高于杆菌肽抗性基因的相对丰度。膦胺霉素抗性基因在籼稻根际中排名前3位。β-内酰胺、磺酰胺和多粘菌素抗性基因在大麦根际的含量远高于其他作物的根际。但在本研究中，在培育15天后，植株仍处于苗期，需要进一步的实验来探索作物生长后期根际微生物群和ARGs的变化。

　　a. 以确定四种植物在3个培育周期中的微生物富集土壤后的根际耐药基因组的宏基因组测序实验方案。b. 3个培育周期中非根际土壤和小麦根际微生物组的丰富度和Shannon指数。c. 3个培育周期中非根际土壤和小麦根际耐药基因组的丰富度和Shannon指数。用不同字母表半岛体育官方网站登录入口示的组中的值有显著差异。d. 三个栽培周期中非根际土壤和小麦根际样品的微生物组(Adonis分析，R2 = 0.8611，P = 0.001)和耐药基因组(Adonis分析，R2 = 0.7037，P = 0.001)的PCoA分析。e. NS和连续三个栽培周期的土壤样品之间的Bray-Curtis差异。数据以均值±标准误差表示。差异的统计学意义如下：**P 0.01，***P0.001(单因素方差分析)；ns，无显著差异。f. Procrustes和Mantel检验结果表明，基于Bray-Curtis差异，根际ARGs、微生物组、插入序列(ISs)、质粒和整合子之间存在显著相关性。箭头的厚度表示R2值(Mental检验)，色标表示M2值(Procrustes检验)。相应的P值代表统计学意义。

　　由于小麦根际耐药基因组的多样性和丰富度均高于其他作物，因此我们选择小麦进行进一步的根际微生物富集实验。在3个栽培周期中，根际和非根际土壤微生物群落的丰富度无显著差异(图3b)，但G3的Shannon指数显著降低。此外，基于Bray-Curtis差异的PCoA结果显示，在三个培育周期的过程中，微生物群落结构发生了显著变化，但G2和G3之间没有显著差异(图3d，e)。耐药基因组表现出与微生物组相同的变化趋势，但比微生物组慢(图3d，e)。结果表明，在多代培育中，耐药基因组与微生物组表现出一致的变化趋势，这也与之前观察到的拟南芥的变化趋势完全一致，耐药基因组在传代培育中表现出滞后性，表明其受到微生物组的影响。

　　为了验证MGEs在植物根际的关键作用，我们采用基于Spearman秩相关的Mantel检验和Procrustes分析，探讨了小麦根际耐药基因组、细菌和MGEs(插入序列(ISs)、质粒和整合子)之间的关系(图3f)。我们发现，细菌和质粒与ARGs的相关性最为显著(P = 0.001)，这些关系的R2值非常接近于1，而M2值非常接近于0。相比之下，ISs和整合子对ARG水平变化的影响相对较小，尽管它们仍然与ARGs水平和细菌显著相关(P 0.01)。这些结果表明，在多个培育周期中，MGEs和微生物组对耐药基因组有显著影响。此外，我们从优势类群中选择了121个富集菌属，包括变形菌门的伯克霍尔德菌和根瘤菌，拟杆菌门中的Cytophagales、Flavobacteriales和Sphingobacteriale，以及酸杆菌门中的Acidobacteriales，它们是最常见的植物有益细菌。

　　对小麦根际富集微生物和耐药基因组进行共现网络分析，发现功能基因与富集微生物显著相关，特别是群体感应的自诱导剂(2131条边-耐药基因组，3584条边-富集微生物组)，其次是氨基酸代谢(704条边-耐药基因组，629条边-富集微生物组)和遗传信息处理(734条边-耐药基因组，493条边-富集微生物组)(图4)。这些基因对植物的生长至关重要。此外，富集的ARGs也与这些功能基因显著相关，我们推测它们之间可能存在共表达关系。基于ARGs与功能基因之间的强相关性，我们进一步鉴定出与富集微生物显著正相关的ARGs，占总ARGs的56%(图5)，这与拟南芥实验中观察到的现象一致。有趣的是，这些ARGs大多在传代培养周期中富集，包括多药、糖肽类和氨基糖苷类耐药基因。这些基因在KEGG数据库中的注释表明，这些ARGs还具有其他功能，如作为膜融合蛋白，参与信号传导和细胞过程、遗传信息处理和双组分系统。因此，在植物栽培过程中富集的大多数ARGs很可能是对植物有益的促生长微生物。

　　图4 具有功能基因的耐药基因组和富集微生物组的共现网络分析。不同的颜色代表ARGs、属和不同的功能基因。圆圈周围的值表示ARGs和属相连的边数。

　　热图显示，核心ARGs(占总数的56%)与富集微生物显著正相关，并在连续的培育周期中不断富集。不同的颜色代表根据功能和类别分类的ARGs。Nor-ppm表示ARGs的归一化丰度。

　　本研究首先利用高通量PCR检测了拟南芥传代培育过程中ARGs的动态变化。中性群落模型中R2值较低，迁移物种数量较少，表明耐药基因组没有发生随机变化，而是发生了显著的方向性变化。根据生态位理论，由于在本对照实验中排除或最小化了非生物因素的影响，根际耐药基因组可能受到特定的植物选择过程的影响。相关分析显示，宿主的特异性影响了不同的微生物组，且部分ARGs在各自植株的传代培育周期中逐渐积累。我们发现在培育周期中MGEs在拟南芥根际富集，可能由于高代谢率和根际细菌的相对流动性或在多代的培育中许多携带MGEs的细菌逐渐在根际中累积。应注意的是，富集微生物如变形菌门、假单胞菌、根瘤菌、Ensife、黄杆菌、Massilia与拟南芥根际ARGs水平相关(图2)，很有可能对植物产生有益影响。因此，我们推测在拟南芥根际富集的ARGs除了具有抗生素抗性外，还具有其他功能。

　　为了进一步证明上述推测，我们首先利用宏基因组测序技术对4种代表性植物的根际耐药基因组进行了研究，并鉴定了它们的各种耐药基因组谱，这也支持了根际耐药基因组依赖于植物宿主的发现。我们还发现，小麦根际中有更多高度多样化的ARGs，所以我们选择该植物进行多代栽培，并使用宏基因组测序技术评估培育周期对根际微生物组、耐药基因组和MGEs的影响。我们观察到在多代培育中，大多数植物有益菌在小麦根际富集，并与大多数ARGs有很强的相关性(约60%)，支持了拟南芥根际实验的结论。此外，MGEs(如ISs、质粒和整合子)在植物传代培育过程中在根际微生物群中显著富集，并驱动了ARG的传播，表明植物根际是ARGs水平基因转移(HGT)的热点区域。其中，质粒的丰度与ARGs的相关性最强。普遍认为，ARGs的传播通常是由HGT介导的，质粒接合是主导途径，ARGs易位到质粒中可以加速ARG的传播。因此，可能是植物对根际特定ARGs的选择压力导致ARGs转位导质粒中，并在环境中的细菌中快速传播。

　　最重要的是，本研究结果还表明，与自诱导剂、氨基酸代谢、碳水化合物代谢、辅因子和维生素代谢相关的基因的丰度与富集的耐药基因组和微生物组都有很强的相关性，表明富集的微生物组可以调控与ARGs共表达的特定基因。例如，自诱导剂是具有群体感应的细菌释放的信号分子，它们的水平随着细胞密度的增加而同步增加。因此，群体感应阻断剂可以减轻土壤ARGs污染。除了这些与共表达相关的功能特征外，富集的ARGs还参与拟南芥根际的信号传导和宿主代谢，这支持了上述推测，即植物根际积极招募携带各种ARGs的有益细菌，以调节植物生长或免疫，而不是调节抗生素耐药风险。虽然这一结论与我们之前注意到的非致病性ARG宿主的低风险相一致，但ARG的富集也增加了它们通过连续种植的重要作物通过食物链传播的风险。

　　综上所述，本研究发现植物根际耐药基因组受植物宿主诱导的定向选择的影响。此外，植物根际的大部分ARGs(约60%)在植物传代培育过程中富集，并与植物招募的有益根际细菌显著相关。虽然这些ARGs可能在根际细菌群落中发挥一些功能，如膜通透性和信号传递等，但植物根际ARGs和MGEs的富集可能进入土壤食物网，造成严重的人类健康风险。本研究结果拓展了对植物耐药基因组的认识，揭示了影响土壤ARGs传播风险的一个新的生态因素，即生物自主行为。综上，本研究结果为植物根际ARG动态积累过程提供了新的见解，对农业可持续发展和生态安全具有重要意义。