半岛体育官方网站登录入口生物技术在园艺植物育种中的应用课件
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生物技术(Biotechnology):以生命科学为基础，利用生物体的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，以及与工程原理相结合进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性技术体系。生物技术是在分子生物学和细胞生物学基础上结合现代工程学的方法和原理而发展起来的一门综合性科学技术。生物技术(Biotechnology):以生命科学为基础，利1第一节组织与器官培养第二节花药与花粉培养第三节原生质体培养第四节体细胞杂交第五节植物细胞突变体的离体筛选第六节基因工程与育种第七节分子标记与育种主要内容：第一节组织与器官培养第二节花药与花粉培养第三节原生质体2植物组织培养
（PlantTissueCulture）将植物离体器官、组织或细胞等外植体，在适宜的人工培养基和无菌条件下，给予光照、温度等环境条件并培养，使其生长、增殖、发育形成小植株的方法。狭义的组织培养仅指愈伤组织培养，广义的组织培养指各种类型的植物无菌培养技术。组织培养概念多指广义上的组织培养技术，包括胚胎培养、器官培养、组织培养(愈伤组织培养)、细胞培养、原生质体培养等。植物组织培养
（PlantTissueCulture）将3植物特殊倍性创造植物组织培养培育植物新品种种苗脱毒与快速繁殖体细胞杂交次生产物生产基础研究植物特殊植物培育植物种苗脱毒与体细胞杂交次生产物基础研究4第一节组织与器官培养组织与器官培养的类别组织与器官培养的应用第一节组织与器官培养组织与器官培养的类别组织与器官培养的5茎尖和分生组织培养胚培养胚珠和子房培养胚乳培养离体叶的培养组织与器官培养
(tissueando6相关专业术语细胞全能性(totipotency):一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力。外植体(explant):用于培养的离体材料。愈伤组织(callus):在培养过程中，从植物各种器官、组织的外植体增殖而形成的一种无特定结构和功能的细胞团。胚状体(embryoid):由外植体或愈伤组织产生的,与正常受精发育方式类似的胚胎结构。继代培养(subculture)：对外植体增殖的培养物(包括细胞、组织或其切段)通过更换新鲜培养基及不断切割或分离，进行连续多代培养。相关专业术语细胞全能性(totipotency):一个细胞7组织和器官培养全过程可分四个阶段:无菌培养物的建立营养繁殖体的增殖生根植株移栽各个阶段在培养基,生长调节剂的配比和浓度,培养方式和环境上都不同的要求.组织和器官培养全过程可分四个阶段:无菌培养物的建立营养繁殖体8组织和器官培养在育种中的作用加快园艺植物新品种和良种繁殖速度培养无病毒苗木诱发和离体筛选突变体进行种质资源长期保存和远距离运输获得倍性不同的植株克服种子发育和萌发中的障碍克服远源杂交困难提供育种中间材料组织和器官培养在育种中的作用加快园艺植物新品种和良种繁殖速度9第二节花药与花粉培养花药培养花粉培养第二节花药与花粉培养花药培养花粉培养10花药培养：其外植体为植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的范畴。花粉培养：将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离，再加以离体培养。有时花粉培养也称为小孢子培养(microsporeculture)。从培养方法和技术方面来讲，它属于细胞培养的范畴。花药培养：其外植体为植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技11花药培养的基本程序外植体选择→外植体(花蕾)预处理→外植体消毒→剥取花药→接种→诱导培养→分化培养花药培养的基本程序12
在离体培养条件下要使花药中的花粉改变其正常发育方向而形成单倍体植株，需要各种因素共同调节和控制。
内因：主要决定于花药中花粉发育时期在离体培养条件下要使花药中的花粉改变其正13培养基花药培养常用的基本培养基：MS（Murashigc&Skoog，1962）；Nitsch(Nitsch，1969)；N6(朱至清，1974)；B5(Gamborgetal.，1976)。附加成分：蔗糖,激素。培养基花药培养常用的基本培养基：14花药培养常用的激素细胞分裂素类：
诱导频率（％）8蔗糖:蔗糖在花药诱导培养阶段的功能主要是：提供C源；维持适宜16花粉发育时期四分体→小孢子→
单核花粉→双核花粉最适期花粉发育时期17花粉及小孢子培养1．取材时期的确定
四分体—单核早期—单核晚期—双核早期—双核晚期—三核期小孢子花粉粒花粉及小孢子培养1．取材时期的确定小孢子花粉粒18花药培养与小孢子培养的目的一样，为获得单倍体。单倍体(haploid):指具有配子体染色体数的孢子体(植物个体)。
草莓2n=8x=56n=4x=28花药培养与小孢子培养的目的一样，为获得单倍体。单倍体(hap19单倍体在育种中有特殊的地位，其作用表现在加倍后可迅速获得纯合型材料，缩短育种年限。获得育种中间材料。与诱变育种相结合可以提高诱变频率。与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义，无籽三倍体。作为遗传工程受体更为有效。用于基础遗传研究的各个领域
。获得超雄植株（YY)。可获得异源体附加系、代换系和易位系。单倍体在育种中有特殊的地位，其作用表现在加倍后可迅速获得纯合20第三节原生质体培养原生质体培养和体细胞杂交的步骤原生质体培养（Protoplastculture）体细胞杂交（Somatichybridization）原生质体融合（Protoplastfusion）第三节原生质体培养原生质体培养和体细胞杂交的步骤21一.原生质体的概念原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的细胞。
亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。
核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体(miniprotoplast)。
胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。一.原生质体的概念原生质体(protoplast)：指除去细22二.原生质体的分离基础材料准备预处理与酶解原生质体活力测定原生质体收集与纯化二.原生质体的分离基础材料准备预处理与酶解原生质体活力测定原231.分离原生质体材料的准备无菌试管苗叶片上胚轴和子叶
培养细胞1.分离原生质体材料的准备无菌试管苗叶片242.预处理及酶解酶酶解渗透压调节剂2.预处理及酶解酶酶解渗透压25材料预处理在游离原生质体前对供体材料进行预处理及预培养，可以提高某些材料原生质体的活力和分裂频率。用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。不同植物及材料类型预处理方法不同。例如龙胆试管苗的叶片只有用4℃低温处理，甘蔗植株必须先在黑暗条件下培养12h后分离的原生质体才能分裂。材料预处理26原生质体分离常用的商品酶
溶剂：原生质体培养基或特殊配制。渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。酶溶剂及其渗透压28酶处理
酶解温度酶浓度酶解时间酶处理酶解温29l3、原生质体的分离纯化l3、原生质体的分离纯化30原生质体的收集和纯化飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll。沉淀法：常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将酶液洗出干净，再用Percoll飘浮一次。
原生质体的收集和纯化飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、Percol314.原生质体活力测定目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。
FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。4.原生质体活力测定目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流32
在荧光显微镜下，有活力的原生质发荧光，无活力的不发荧光。生活力测定：FDA荧光染色法(双醋酸荧光素)生活力测定：33影响原生质体活力的因素分离材料的生理状态
酶解条件酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压分离条件离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间环境条件操作环境的温度、分离用具的影响
34三、原生质体培养原生质体培养基原生质体培养方法三、原生质体培养原生质体培养基原生质体培养方法351.原生质体培养基无机盐大量元素浓度；NO3－和NH4+的比例；Ca2+浓度有机成分
维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。1.原生质体培养基无机盐362、原生质体培养方法液体浅层培养固体平板培养固-液体双层培养琼脂糖珠培养2、原生质体培养方法液体浅层培养37
原生质体培养原生质体培养38柑桔融合实例柑桔融合实例39生物技术在园艺植物育种中的应用课件40第四节体细胞杂交定义：将两个不同亲本的原生质体，经人工诱导融合并培养再生成株的过程，统称为体细胞杂交（A+B）几种不同的表述：体细胞杂交：Somatichybridization
细胞工程：Cellengineering第四节体细胞杂交定义：将两个不同亲本的原生质体，经人工诱导41植物细胞杂交的几个重要进展
1960年，Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功；1971年，Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株；1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这是第一个植物细胞杂种；1974年，Kao将聚乙二醇诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术；1978年，Melchers获得第1个属间细胞杂种（番茄＋马铃薯）；1981年，Zimmerman发明电融合仪，并首次提出电融合概念；1987年，Schweiger建立单对原生质体电融合技术程序。植物细胞杂交的几个重要进展42体细胞杂交与有性杂交的异同比较内容体细胞杂交有性杂交时间无季节限制花期限制，特别是母本的花期亲缘关系一定程度上可以克服有性/嫁接不亲和性受亲和性影响结果细胞核、细胞质均可以重组、倍性增加双受精，一般无细胞质重组，倍性不改变体细胞杂交与有性杂交的异同比较内容体细胞杂交有性杂交时间无季43+体细胞杂交有性杂交+体细胞杂交有性杂交44原生质体融合的有关名词-I对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质均为100%）非对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质不等（相对值）胞质杂种（cytoplasmichybrid,Cybrid）：细胞质重组，细胞核未重组对称融合（symmetricfusion）也称标准融合（Standardfusion）非对称融合（asymmetricfusion）：融合前对一方进行处理，使其染色体丢失一部分原生质体融合的有关名词-I对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质45原生质体融合的有关名词-II供-受体融合：Donor-recipientfusion体配融合（gameto-somaticfusion）（性细胞与体细胞融合）亚原生质体-原生质体融合：
理论上，任何细胞都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源，这对种质资源的开发和利用具有深远的意义。融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。理论上，任何细胞都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源，48体细胞杂交的程序及方法原生质体融合杂种细胞筛选方法：PEG，电融合，NaNO3营养互补选择法，遗传互补选择法，机械选择法，形态学方法细胞学方法同工酶方法分子标记法体细胞杂种植株的鉴定体细胞杂交的程序及方法原生质体融合杂种细胞筛选方法：PEG，49亲本A亲本B原生质体聚合融合处理分离的原生质体原生质体融合融合体移植杂种融合体筛选杂种融合体移栽至不同的培养基体细胞杂交筛选亲本A亲本B原生质体聚合融合处理分离的原生质体原生质体融合融50原生质体培养和体细胞杂交的应用获得新品种；创造新种质；转移有利性状和克服远源杂交的障碍；作为基因工程的良好受体及进行突变体筛选的优良原始材料。原生质体培养和体细胞杂交的应用获得新品种；51第五节植物细胞突变体的离体筛选
在离体培养条件下，诱发突变的突变型和自发突变没有本质上的差别。一般都在三个水平上发生：基因组突变：染色体数目的改变或细胞质基因组的增减；染色体突变：染色体较大范围的结构变化，涉及多个基因；基因突变：指范围在一个基因以内分子结构的改变。按DNA改变方式有碱基置换突变，移码突变，缺失突变和插入突变。体细胞无性系变异：Somaclonalvariation一、突变体的产生第五节植物细胞突变体的离体筛选一、突变52二、突变细胞的筛选方法直接选择法
正选择/负选择间接选择法二、突变细胞的筛选方法直接选择法间接选择法53正选择用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基上只有突变细胞能够生长，非突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变体。如抗除草剂、抗盐碱突变体的筛选，均可直接在培养基中加入一定浓度的除草剂或增加渗透压的物质。目前采用这一途径，已从多种植物中筛选出可利用的体细胞变异体。贾敬芬等以小麦幼胚愈伤组织为材料，在含有1.4％NaCl的N6培养基上直接筛选出小麦耐盐系。分析显示，耐盐系游离氨基酸含量是供体亲本的4.1倍。郑企成等也曾将小麦“京花1号”花药经γ射线％NaCl培养基直接筛选获得耐盐再生株系。李爱贤等以甘薯“栗子香”为材料诱导胚性细胞系，从900个通过γ射线辐射的细胞团中，在含有2.0％NaCl的培养基中进行筛选，获得22个抗盐愈伤组织，并获得20个抗盐再生植株。正选择用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基上只有突变细54负选择一种借助于与突变表现型有关的性状作为选择指标的筛选方法。Dorffling等以Pro类似物羟脯氨酸（HYP）为选择剂，获得了耐HYP的体细胞变异系，其抗寒性比供体亲本增强，且能稳定遗传。林定波等将锦橙株心细胞愈伤组织的悬浮细胞经γ射线照射，然后在高浓度脯氨酸培养基中培养筛选，获得了抗寒体细胞变异愈伤组织，并再生植株。鉴定显示，抗寒愈伤组织及其再生植株的抗寒性分别比供体提高1.4℃和2.4℃，突变系体内的Pro含量比供体增加了一倍。
负选择一种借助于与突变表现型有关的性状作为选择指标的筛选方法55三、突变性状遗传基础及其稳定性鉴定遗传基础稳定性三、突变性状遗传基础及其稳定性鉴定遗传基础稳定性56突变性状的遗传学基础体细胞变异，除发生在染色体水平外，更多的是基因水平上的变异。从利用体细胞变异的角度，染色体变异大多是一些畸形变异，真正可利用的染色体变异十分有限。基因水平上的变异在表型上大多只是个别性状的改变，不会影响再生植株的正常生长发育。因此，从再生植株的这些变异中有可能筛选有益的变异。基因水平上的变异，从根本上讲是DNA的碱基突变或修饰状态的改变。
突变性状的遗传学基础体细胞变异，除发生在染色体水平外，更多的57突变性状的稳定性对于单基因控制的遗传性状，大多数碱基突变可以稳定遗传而且符合孟德尔遗传分离规律，这一点已在水稻、烟草和玉米的体细胞变异中得以证实。Brettell等从645株玉米杂种胚培养再生植株中，发现了一个稳定突变体Adh1（乙醇脱氢酶突变体），克隆基因序列分析发现，该基因第七外显子中一个编码谷氨酸的GAG中的A转换成为了T，使翻译肽链中的谷氨酸转变为纈氨酸。植物的许多性状特别是经济性状均由多基因控制，对于多基因控制性状的碱基突变可能由于技术上的复杂性，目前还没有关于多基因控制性状的碱基突变报道。突变性状的稳定性对于单基因控制的遗传性状，大多数碱基突变可以58GeneticEngineeringandBreeding第六节基因工程与育种GeneticEngineeringandBreedi59植物基因工程（plantgeneticengineering）：指以类似工程设计的方法，按照人们的意志，通过一定的程序，将具有遗传信息的DNA片断，在离体条件下，用工具酶加以剪切、组合和拼接，再将人工重组的基因引入适当的植物受体中进行复制和表达的技术。转基因植物：transgenicplant转基因技术:Transgenictechnique植物基因工程（plantgeneticengineeri60一、Definition
指把不同生物有机体的DNA（或基因）分离提取出来，在体外进行酶切和连接，构成重组DNA(recombinationDNA)分子，然后转化到受体细胞（如,大肠杆菌），使外源基因在受体细胞中复制增殖，然后借助生物的或理化的方法将外源基因导入到植物细胞，进行转译和表达。基因工程:一、Definition指把不同生物有机61基因分离、克隆农杆菌介导基因枪介导基因插入Ti/Ri质粒载体农杆菌侵染植物包裹DNA的微粒弹质粒DNA制备基因质粒进入植物细胞DNA整合进植物染色体基因枪轰击植物细胞检测转基因筛选转基因细胞转基因细胞再生植株检测转基因农杆菌和基因枪介导基因转化流程图基因分离、克隆农杆菌介导基因枪介导基因插入Ti/Ri质粒载体62基因工程的基本步骤和方法目的基因的分离与鉴定植物表达载体的构建植物的遗传转化转化植物细胞的筛选及转基因植物的鉴定基因工程的基本步骤和方法目的基因的分离与鉴定63各种来源目的基因的分离与克隆克隆基因的鉴定和分析有用基因的亚克隆待改良植物的选择和预处理植物受体细胞系统制备植物细胞的遗传转化异源基因在植物细胞中的整合与表达转基因植株的育成和转化含异源基因的重组细胞的筛选和培养重组细胞的分裂与分化植物基因转移的过程各种来源目的基克隆基因的鉴定和分析有用基因的亚克隆待改良植物64二、基因工程在园艺植物育种中的应用改良品质提高抗病虫能力改良抗逆性提高光合作用和固氮效率创建雄性不育材料延迟成熟与保鲜选育抗除草剂品种二、基因工程在园艺植物育种中的应用改良品质65
如.1986年Beachy等将烟草花叶病毒的外壳蛋白基因（TMV-CP)导入烟草中，发现转基因植株发病时间明显延迟或病毒的症状明显减轻。抗病毒基因工程途径:☆向植物中导入病毒外壳蛋白（CP）
苏云金芽孢杆菌（Bt)制剂产生的原毒素－伴孢晶体毒蛋白（δ内毒素），可在昆虫幼虫中肠道的水解酶作用下，转化成小分子的毒素多肽，而对多种昆虫有很强的毒杀作用。导入Bt毒蛋白基因提高抗虫能力苏云金芽孢杆菌（Bt)制剂产生的原79
Hinder等将编码豇豆胰蛋白酶抑制物（CpTI)的基因转移到烟草中，明显增强了转基因烟草对烟草夜蛾幼虫的抗性。
如将蜘蛛杀虫肽基因导入烟草，转基因烟草表现出对棉铃虫有较强的抗性。利用一些昆虫毒素基因导入蛋白酶抑制剂Hinder等将编码豇豆胰蛋白酶抑制物（Cp80改善抗逆性
如：甜菜碱醛脱氢酶（BADH)基因导入烟草、草莓和水稻后，转基因植物的耐盐性明显提高。向植物中导入热休克基因，可提高其抗热性将深海鱼美洲拟鲽的抗冻基因通过柱头导入番茄，获得可耐受-4∽-5℃低温的转基因番茄。导入与脯氨酸或甜菜碱合成有关的酶的基因改善抗逆性如：甜菜碱醛脱氢酶（BADH)基因导入烟草、草81转基因烟草的光合特性1℃处理4h，27℃测定光合作用，低温导致的光合作用下降率为：转拟南芥菜的为7％，转南瓜的为88％，对照的为25％。转基因烟草的光合特性1℃处理4h，27℃测定光82转基因植株的脂肪酸的构成转入抗寒性强的拟南芥菜的基因，其不饱和脂肪酸的含量显著增加转入抗寒性弱的南瓜的基因，其饱和脂肪酸的含量显著增加转基因植株的脂肪酸的构成转入抗寒性强的拟南芥菜的基因，其不饱83转基因烟草的抗寒性转基因烟草在1℃下处理10d，25℃栽培2d，前者无黄化，后者有黄化。a.野生型；b.对照pBI121；c.南瓜；d.拟南芥菜转基因烟草的抗寒性转基因烟草在1℃下处理10d，25℃栽84
现已在矮牵牛、烟草、番茄、马铃薯、大豆、油菜、杨树等植物上获得抗除草剂的转基因植株。
如bar基因编码PPT乙酰转移酶，导入烟草，番茄和马铃薯等植物后，使作物获得抗除草剂PPT的能力选育抗除草剂品种把除草剂作用的靶酶或靶蛋白质的基因导入植物85
美国Calgene公司以将反义PGcDNA导入到番茄中，育成“FLAVRSAVE”转基因品种，并已上市叶志彪等利用ACC氧化酶反义基因转入番茄，抑制ACC合成酶的表达活性，抑制乙烯的合成，育成耐贮藏的转基因番茄。延迟成熟与保鲜改变果实细胞壁降解酶活性86苹果乙烯形成的沉默实例苹果乙烯形成的沉默实例87对照转基因苹果乙烯生成减少70%需更长时间软化硬度：高于CK比CK耐贮藏
提高产量☆提高光合作用效率和固氮效率☆克隆与杂种优势相关的植物雄性不育有关的基因
Worral等报道用编码ß-1,3葡聚糖水解酶基因转化烟草、矮牵牛获得雄性不育植株提高产量☆提高光合作用效率和固氮效率90
☆将人工合成的富含必须氨基酸的DNA片段导入马铃薯，能有效地改善马铃薯贮藏蛋白的氨基酸成分。
☆通过导入淀粉粒结合的淀粉合成酶的反义RNA基因，可改变马铃薯支链淀粉和直链淀粉的比例。改良品质☆将人工合成的富含必须氨基酸的DNA片段导入91☆陈章良将Chs的反义基因转入矮牵牛中，导致Chs的mRNA水平以及Chs的酶活性都大大降低，可改变矮牵牛的颜色。☆异戊烯转移酶基因(ipt)导入番茄可使果实可溶性固形物含量显著增加。☆陈章良将Chs的反义基因转入矮牵牛中，导致Chs的mR92MdTFL（抑制芽分生组织identity基因）：苹果顶端分生组织从营养期向生殖期的转变
提前开花结实实例：苹果早花早实MdTFL（抑制芽分生组织identity基因）：苹果顶端分93嫁接后8个月嫁接后8个月94早花苹果的花和果实早花苹果的花和果实95转Leafy基因杨树早花转Leafy基因杨树早花96三、转基因植株的筛选方法：形态学鉴定直接选择法间接选择法同工酶测定分子标记三、转基因植株的筛选方法：97第七节分子标记与育种
Molecularmarker&98形态标记（morphologicalmarkers）细胞学标记（cytologicalmarkers）生化标记（biochemicalmarkers）分子标记（molecularmarkers）遗传标记的种类遗传标记（geneticmarkers）：鉴别基因组中基因位点(site)的手段，是易于识别且可遗传的实体。种类：形态标记（morphologicalmarkers）遗传标99形态标记形态标记：指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状，如株高、果形、花色、叶形、花瓣数多少、核有无或抗逆性、抗病性等。特点：简单直观，长期以来，作物种质资源鉴定及育种材料的选择一般都是根据形态标记进行的，但是形态标记数目少，多态性差，易受环境因素的影响。应用实例：园艺植物品种识别枳在柑桔原生质体融合中的应用形态标记形态标记：指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状，如100细胞学标记细胞学标记：染色体的结构特征和数量特征是常见的细胞学标记，它们分别反映了染色体结构上和数量上的遗传多态性。染色体结构特征包括染色体的核型(染色体相对长度、臂指数、着丝粒指数、染色体臂数等)和带型(Constitutiveheterochrom-ativebanding带、Necleolarorganizerregionbanding带、Giemsabanding带等)。特点：可明确鉴定许多物种中任一染色体。操作复杂，信息量小。应用实例：
资源分类与品种鉴别多倍体亲缘关系与系统进化染色体组分析评价亲缘关系原位杂交进行基因物理定位细胞学标记细胞学标记：染色体的结构特征和数量特征是常见的细胞101生化标记同工酶同工酶：指有同一底物专一性，催化同一化学反应，结构、组成不同的一类酶。基本原理是根据电荷性质的差异，通过蛋白质电泳或色谱技术和专门染色反应显示出同工酶的不同形式，从而鉴别不同的基因型。特点：受环境因素影响小，呈共显性，在分离世代中能反映各单株的基因型，检测相对简单快速，在种子和幼苗期就可以鉴定，费用不高。具有组织、发育和物种特异性。应用实例：
品种质量和纯度鉴定遗传多样性研究生化标记同工酶同工酶：指有同一底物专一性，催化同一化学反应，102分子标记分子标记：以直接检测DNA碱基序列的差异为基础的遗传标记，又叫DNA分子标记。特点：数量多，遍布整个基因组；标记本身无害，很少与不良性状连锁；标记不需要基因表达，可用个体的任何材料进行检测，不受环境条件的限制；多态性高，自然界存在着许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料；有许多分子标记表现为共显性，能够鉴别出纯合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息。多以DNA片段电泳谱带形式表现。应用：
种质资源研究辅助育种功能基因组研究基因克隆分子标记分子标记：以直接检测DNA碱基序列的差异为基础的遗传103RFLPRAPDSAPMacrosateliteMinisateliteAFLP遗传特性共显性显性显性/共显性显性共显性显性/共显性多态性水平低中等低高高高可检测座位数1～41～101几十～100几十100～200检测基础分子杂交随机PCR专一PCR专一PCR分子杂交专一PCR检测基因组部位单/低拷贝区整个基因组整个基因组重复序列区重复序列区整个基因组使用技术难度难易易易难易DNA质量要求5～10ug50ng50ng50ng5~10ug50ng是否使用测位数是否否否是否探针DNA短片断随机引物专一性引物专一性引物DNA短片断专一性引物费用中等低高高中等高注：引自钱赢荣，郑康乐。生物工程进展，1998，（3）：12几种常用分子标记方法比较RFLPRAPDSAPMacrosateliteMinisa104RAPD标记鉴定5101100670bp00bp1314RAPD标记鉴定5101100670bp分子标记在园艺植物育种的应用构建遗传图谱分析亲缘关系定位农艺性状分子标记辅助选择种质资源及杂种后代的鉴定分子标记在园艺植物育种的应用构建遗传图谱106复习题基本概念：生物技术、组织培养、外植体、体细胞杂交、体细胞无性系变异、基因工程、分子标记简述各项生物技术方法在园艺植物育种中的主要应用。复习题基本概念：生物技术、组织培养、外植体、体细胞杂交、体细107生物技术(Biotechnology):以生命科学为基础，利用生物体的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，以及与工程原理相结合进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性技术体系。生物技术是在分子生物学和细胞生物学基础上结合现代工程学的方法和原理而发展起来的一门综合性科学技术。生物技术(Biotechnology):以生命科学为基础，利108第一节组织与器官培养第二节花药与花粉培养第三节原生质体培养第四节体细胞杂交第五节植物细胞突变体的离体筛选第六节基因工程与育种第七节分子标记与育种主要内容：第一节组织与器官培养第二节花药与花粉培养第三节原生质体109植物组织培养
（PlantTissueCulture）将植物离体器官、组织或细胞等外植体，在适宜的人工培养基和无菌条件下，给予光照、温度等环境条件并培养，使其生长、增殖、发育形成小植株的方法。狭义的组织培养仅指愈伤组织培养，广义的组织培养指各种类型的植物无菌培养技术。组织培养概念多指广义上的组织培养技术，包括胚胎培养、器官培养、组织培养(愈伤组织培养)、细胞培养、原生质体培养等。植物组织培养
（PlantTissueCulture）将110植物特殊倍性创造植物组织培养培育植物新品种种苗脱毒与快速繁殖体细胞杂交次生产物生产基础研究植物特殊植物培育植物种苗脱毒与体细胞杂交次生产物基础研究111第一节组织与器官培养组织与器官培养的类别组织与器官培养的应用第一节组织与器官培养组织与器官培养的类别组织与器官培养的112茎尖和分生组织培养胚培养胚珠和子房培养胚乳培养离体叶的培养组织与器官培养
(tissueando113相关专业术语细胞全能性(totipotency):一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力。外植体(explant):用于培养的离体材料。愈伤组织(callus):在培养过程中，从植物各种器官、组织的外植体增殖而形成的一种无特定结构和功能的细胞团。胚状体(embryoid):由外植体或愈伤组织产生的,与正常受精发育方式类似的胚胎结构。继代培养(subculture)：对外植体增殖的培养物(包括细胞、组织或其切段)通过更换新鲜培养基及不断切割或分离，进行连续多代培养。相关专业术语细胞全能性(totipotency):一个细胞114组织和器官培养全过程可分四个阶段:无菌培养物的建立营养繁殖体的增殖生根植株移栽各个阶段在培养基,生长调节剂的配比和浓度,培养方式和环境上都不同的要求.组织和器官培养全过程可分四个阶段:无菌培养物的建立营养繁殖体115组织和器官培养在育种中的作用加快园艺植物新品种和良种繁殖速度培养无病毒苗木诱发和离体筛选突变体进行种质资源长期保存和远距离运输获得倍性不同的植株克服种子发育和萌发中的障碍克服远源杂交困难提供育种中间材料组织和器官培养在育种中的作用加快园艺植物新品种和良种繁殖速度116第二节花药与花粉培养花药培养花粉培养第二节花药与花粉培养花药培养花粉培养117花药培养：其外植体为植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的范畴。花粉培养：将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离，再加以离体培养。有时花粉培养也称为小孢子培养(microsporeculture)。从培养方法和技术方面来讲，它属于细胞培养的范畴。花药培养：其外植体为植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技118花药培养的基本程序外植体选择→外植体(花蕾)预处理→外植体消毒→剥取花药→接种→诱导培养→分化培养花药培养的基本程序119
在离体培养条件下要使花药中的花粉改变其正常发育方向而形成单倍体植株，需要各种因素共同调节和控制。
内因：主要决定于花药中花粉发育时期在离体培养条件下要使花药中的花粉改变其正120培养基花药培养常用的基本培养基：MS（Murashigc&Skoog，1962）；Nitsch(Nitsch，1969)；N6(朱至清，1974)；B5(Gamborgetal.，1976)。附加成分：蔗糖,激素。培养基花药培养常用的基本培养基：121花药培养常用的激素细胞分裂素类：
诱导频率（％）8蔗糖:蔗糖在花药诱导培养阶段的功能主要是：提供C源；维持适宜123花粉发育时期四分体→小孢子→
单核花粉→双核花粉最适期花粉发育时期124花粉及小孢子培养1．取材时期的确定
四分体—单核早期—单核晚期—双核早期—双核晚期—三核期小孢子花粉粒花粉及小孢子培养1．取材时期的确定小孢子花粉粒125花药培养与小孢子培养的目的一样，为获得单倍体。单倍体(haploid):指具有配子体染色体数的孢子体(植物个体)。
草莓2n=8x=56n=4x=28花药培养与小孢子培养的目的一样，为获得单倍体。单倍体(hap126单倍体在育种中有特殊的地位，其作用表现在加倍后可迅速获得纯合型材料，缩短育种年限。获得育种中间材料。与诱变育种相结合可以提高诱变频率。与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义，无籽三倍体。作为遗传工程受体更为有效。用于基础遗传研究的各个领域
。获得超雄植株（YY)。可获得异源体附加系、代换系和易位系。单倍体在育种中有特殊的地位，其作用表现在加倍后可迅速获得纯合127第三节原生质体培养原生质体培养和体细胞杂交的步骤原生质体培养（Protoplastculture）体细胞杂交（Somatichybridization）原生质体融合（Protoplastfusion）第三节原生质体培养原生质体培养和体细胞杂交的步骤128一.原生质体的概念原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的细胞。
亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。
核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体(miniprotoplast)。
胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。一.原生质体的概念原生质体(protoplast)：指除去细129二.原生质体的分离基础材料准备预处理与酶解原生质体活力测定原生质体收集与纯化二.原生质体的分离基础材料准备预处理与酶解原生质体活力测定原1301.分离原生质体材料的准备无菌试管苗叶片上胚轴和子叶
培养细胞1.分离原生质体材料的准备无菌试管苗叶片1312.预处理及酶解酶酶解渗透压调节剂2.预处理及酶解酶酶解渗透压132材料预处理在游离原生质体前对供体材料进行预处理及预培养，可以提高某些材料原生质体的活力和分裂频率。用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。不同植物及材料类型预处理方法不同。例如龙胆试管苗的叶片只有用4℃低温处理，甘蔗植株必须先在黑暗条件下培养12h后分离的原生质体才能分裂。材料预处理133原生质体分离常用的商品酶
溶剂：原生质体培养基或特殊配制。渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。酶溶剂及其渗透压135酶处理
酶解温度酶浓度酶解时间酶处理酶解温136l3、原生质体的分离纯化l3、原生质体的分离纯化137原生质体的收集和纯化飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll。沉淀法：常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将酶液洗出干净，再用Percoll飘浮一次。
原生质体的收集和纯化飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、Percol1384.原生质体活力测定目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。
FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。4.原生质体活力测定目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流139
在荧光显微镜下，有活力的原生质发荧光，无活力的不发荧光。生活力测定：FDA荧光染色法(双醋酸荧光素)生活力测定：140影响原生质体活力的因素分离材料的生理状态
酶解条件酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压分离条件离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间环境条件操作环境的温度、分离用具的影响
141三、原生质体培养原生质体培养基原生质体培养方法三、原生质体培养原生质体培养基原生质体培养方法1421.原生质体培养基无机盐大量元素浓度；NO3－和NH4+的比例；Ca2+浓度有机成分
维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。1.原生质体培养基无机盐1432、原生质体培养方法液体浅层培养固体平板培养固-液体双层培养琼脂糖珠培养2、原生质体培养方法液体浅层培养144
原生质体培养原生质体培养145柑桔融合实例柑桔融合实例146生物技术在园艺植物育种中的应用课件147第四节体细胞杂交定义：将两个不同亲本的原生质体，经人工诱导融合并培养再生成株的过程，统称为体细胞杂交（A+B）几种不同的表述：体细胞杂交：Somatichybridization
细胞工程：Cellengineering第四节体细胞杂交定义：将两个不同亲本的原生质体，经人工诱导148植物细胞杂交的几个重要进展
1960年，Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功；1971年，Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株；1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这是第一个植物细胞杂种；1974年，Kao将聚乙二醇诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术；1978年，Melchers获得第1个属间细胞杂种（番茄＋马铃薯）；1981年，Zimmerman发明电融合仪，并首次提出电融合概念；1987年，Schweiger建立单对原生质体电融合技术程序。植物细胞杂交的几个重要进展149体细胞杂交与有性杂交的异同比较内容体细胞杂交有性杂交时间无季节限制花期限制，特别是母本的花期亲缘关系一定程度上可以克服有性/嫁接不亲和性受亲和性影响结果细胞核、细胞质均可以重组、倍性增加双受精，一般无细胞质重组，倍性不改变体细胞杂交与有性杂交的异同比较内容体细胞杂交有性杂交时间无季150+体细胞杂交有性杂交+体细胞杂交有性杂交151原生质体融合的有关名词-I对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质均为100%）非对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质不等（相对值）胞质杂种（cytoplasmichybrid,Cybrid）：细胞质重组，细胞核未重组对称融合（symmetricfusion）也称标准融合（Standardfusion）非对称融合（asymmetricfusion）：融合前对一方进行处理，使其染色体丢失一部分原生质体融合的有关名词-I对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质152原生质体融合的有关名词-II供-受体融合：Donor-recipientfusion体配融合（gameto-somaticfusion）（性细胞与体细胞融合）亚原生质体-原生质体融合：
理论上，任何细胞都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源，这对种质资源的开发和利用具有深远的意义。融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。理论上，任何细胞都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源，155体细胞杂交的程序及方法原生质体融合杂种细胞筛选方法：PEG，电融合，NaNO3营养互补选择法，遗传互补选择法，机械选择法，形态学方法细胞学方法同工酶方法分子标记法体细胞杂种植株的鉴定体细胞杂交的程序及方法原生质体融合杂种细胞筛选方法：PEG，156亲本A亲本B原生质体聚合融合处理分离的原生质体原生质体融合融合体移植杂种融合体筛选杂种融合体移栽至不同的培养基体细胞杂交筛选亲本A亲本B原生质体聚合融合处理分离的原生质体原生质体融合融157原生质体培养和体细胞杂交的应用获得新品种；创造新种质；转移有利性状和克服远源杂交的障碍；作为基因工程的良好受体及进行突变体筛选的优良原始材料。原生质体培养和体细胞杂交的应用获得新品种；158第五节植物细胞突变体的离体筛选
在离体培养条件下，诱发突变的突变型和自发突变没有本质上的差别。一般都在三个水平上发生：基因组突变：染色体数目的改变或细胞质基因组的增减；染色体突变：染色体较大范围的结构变化，涉及多个基因；基因突变：指范围在一个基因以内分子结构的改变。按DNA改变方式有碱基置换突变，移码突变，缺失突变和插入突变。体细胞无性系变异：Somaclonalvariation一、突变体的产生第五节植物细胞突变体的离体筛选一、突变159二、突变细胞的筛选方法直接选择法
正选择/负选择间接选择法二、突变细胞的筛选方法直接选择法间接选择法160正选择用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基上只有突变细胞能够生长，非突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变体。如抗除草剂、抗盐碱突变体的筛选，均可直接在培养基中加入一定浓度的除草剂或增加渗透压的物质。目前采用这一途径，已从多种植物中筛选出可利用的体细胞变异体。贾敬芬等以小麦幼胚愈伤组织为材料，在含有1.4％NaCl的N6培养基上直接筛选出小麦耐盐系。分析显示，耐盐系游离氨基酸含量是供体亲本的4.1倍。郑企成等也曾将小麦“京花1号”花药经γ射线％NaCl培养基直接筛选获得耐盐再生株系。李爱贤等以甘薯“栗子香”为材料诱导胚性细胞系，从900个通过γ射线辐射的细胞团中，在含有2.0％NaCl的培养基中进行筛选，获得22个抗盐愈伤组织，并获得20个抗盐再生植株。正选择用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基上只有突变细161负选择一种借助于与突变表现型有关的性状作为选择指标的筛选方法。Dorffling等以Pro类似物羟脯氨酸（HYP）为选择剂，获得了耐HYP的体细胞变异系，其抗寒性比供体亲本增强，且能稳定遗传。林定波等将锦橙株心细胞愈伤组织的悬浮细胞经γ射线照射，然后在高浓度脯氨酸培养基中培养筛选，获得了抗寒体细胞变异愈伤组织，并再生植株。鉴定显示，抗寒愈伤组织及其再生植株的抗寒性分别比供体提高1.4℃和2.4℃，突变系体内的Pro含量比供体增加了一倍。
负选择一种借助于与突变表现型有关的性状作为选择指标的筛选方法162三、突变性状遗传基础及其稳定性鉴定遗传基础稳定性三、突变性状遗传基础及其稳定性鉴定遗传基础稳定性163突变性状的遗传学基础体细胞变异，除发生在染色体水平外，更多的是基因水平上的变异。从利用体细胞变异的角度，染色体变异大多是一些畸形变异，真正可利用的染色体变异十分有限。基因水平上的变异在表型上大多只是个别性状的改变，不会影响再生植株的正常生长发育。因此，从再生植株的这些变异中有可能筛选有益的变异。基因水平上的变异，从根本上讲是DNA的碱基突变或修饰状态的改变。
突变性状的遗传学基础体细胞变异，除发生在染色体水平外，更多的164突变性状的稳定性对于单基因控制的遗传性状，大多数碱基突变可以稳定遗传而且符合孟德尔遗传分离规律，这一点已在水稻、烟草和玉米的体细胞变异中得以证实。Brettell等从645株玉米杂种胚培养再生植株中，发现了一个稳定突变体Adh1（乙醇脱氢酶突变体），克隆基因序列分析发现，该基因第七外显子中一个编码谷氨酸的GAG中的A转换成为了T，使翻译肽链中的谷氨酸转变为纈氨酸。植物的许多性状特别是经济性状均由多基因控制，对于多基因控制性状的碱基突变可能由于技术上的复杂性，目前还没有关于多基因控制性状的碱基突变报道。突变性状的稳定性对于单基因控制的遗传性状，大多数碱基突变可以165GeneticEngineeringandBreeding第六节基因工程与育种GeneticEngineeringandBreedi166植物基因工程（plantgeneticengineering）：指以类似工程设计的方法，按照人们的意志，通过一定的程序，将具有遗传信息的DNA片断，在离体条件下，用工具酶加以剪切、组合和拼接，再将人工重组的基因引入适当的植物受体中进行复制和表达的技术。转基因植物：transgenicplant转基因技术:Transgenictechnique植物基因工程（plantgeneticengineeri167一、Definition
指把不同生物有机体的DNA（或基因）分离提取出来，在体外进行酶切和连接，构成重组DNA(recombinationDNA)分子，然后转化到受体细胞（如,大肠杆菌），使外源基因在受体细胞中复制增殖，然后借助生物的或理化的方法将外源基因导入到植物细胞，进行转译和表达。基因工程:一、Definition指把不同生物有机168基因分离、克隆农杆菌介导基因枪介导基因插入Ti/Ri质粒载体农杆菌侵染植物包裹DNA的微粒弹质粒DNA制备基因质粒进入植物细胞DNA整合进植物染色体基因枪轰击植物细胞检测转基因筛选转基因细胞转基因细胞再生植株检测转基因农杆菌和基因枪介导基因转化流程图基因分离、克隆农杆菌介导基因枪介导基因插入Ti/Ri质粒载体169基因工程的基本步骤和方法目的基因的分离与鉴定植物表达载体的构建植物的遗传转化转化植物细胞的筛选及转基因植物的鉴定基因工程的基本步骤和方法目的基因的分离与鉴定170各种来源目的基因的分离与克隆克隆基因的鉴定和分析有用基因的亚克隆待改良植物的选择和预处理植物受体细胞系统制备植物细胞的遗传转化异源基因在植物细胞中的整合与表达转基因植株的育成和转化含异源基因的重组细胞的筛选和培养重组细胞的分裂与分化植物基因转移的过程各种来源目的基克隆基因的鉴定和分析有用基因的亚克隆待改良植物171二、基因工程在园艺植物育种中的应用改良品质提高抗病虫能力改良抗逆性提高光合作用和固氮效率创建雄性不育材料延迟成熟与保鲜选育抗除草剂品种二、基因工程在园艺植物育种中的应用改良品质172
如.1986年Beachy等将烟草花叶病毒的外壳蛋白基因（TMV-CP)导入烟草中，发现转基因植株发病时间明显延迟或病毒的症状明显减轻。抗病毒基因工程途径:☆向植物中导入病毒外壳蛋白（CP）
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