半岛体育官方网站登录入口植物细胞培养的基本技术_图文

　　一、植物材料的准备一、植物材料的准备二、培养基的准备二、培养基的准备三、培养方法的选择三、培养方法的选择外植体：外植体：植物组织培养中作为离体培养材料的器官或植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织的片段组织的片段。在继代培养时，将培养的组织切段移入新的在继代培养时，将培养的组织切段移入新的培养基时，这种切段也称外植体。培养基时，这种切段也称外植体。来源：来源：（（11）、生长健壮）、生长健壮在生长健壮的无病虫的植株上，选取发育正在生长健壮的无病虫半岛体育官方网站登录入口的植株上，选取发育正常的器官或组织。常的器官或组织。原因：原因：aa、代谢旺盛、代谢旺盛bb、再生能力强（比较容易培养成功）、再生能力强（比较容易培养成功）（（22）、不同部位）、不同部位：：靠近植株的近基部比较易成功。靠近植株的近基部比较易成功。选取：选取：建立建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异材料而异。。材料材料太大太大::易污染，也不需要；易污染，也不需要；材料材料太小太小::多形成愈伤组织，甚至难于成活。多形成愈伤组织，甚至难于成活。一般一般选取培养材料的大小，在选取培养材料的大小，在0.5cm0.5cm——1.0cm1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。则应更小。植物组织培养的外植体必须是植物组织培养的外植体必须是。培养。培养前要进行严格的前要进行严格的种质种质库库（种质库是用来保存种质资源（一般（种质库是用来保存种质资源（一般为种子）的低温保存设施为种子）的低温保存设施。。国家国家种质库是全国作物种质资源长期保存与种质库是全国作物种质资源长期保存与研究中心。该库在美国洛克菲勒基金会和国研究中心。该库在美国洛克菲勒基金会和国际植物遗传资源委员会的部分资助下，于际植物遗传资源委员会的部分资助下，于19861986年年1010月在中国农业科学院落成，隶属于月在中国农业科学院落成，隶属于作物品种资源研究所。）作物品种资源研究所。）污染污染：是指在组织培养过程中培养基和培：是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。（（11）、从）、从病源菌方面来分析主要有：病源菌方面来分析主要有：细菌细菌线）、从）、从污染的途径而言主要是：污染的途径而言主要是：外植体带菌外植体带菌培养基及器皿灭菌不彻底、培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等。操作人员未遵守操作规程等。选择选择灭菌剂的灭菌剂的原则原则：：（（11）、）、灭菌灭菌后易除去或易分解后易除去或易分解；；（（22）、敏感敏感的的外植体的灭菌时间外植体的灭菌时间不宜过不宜过长长不敏感的不敏感的外植体的外植体的灭菌时间灭菌时间应适当应适当延长延长氯化汞氯化汞灭菌效果最好，但去除也最困难，且灭菌时间不宜过长，以免损伤或杀死植物细胞。氯化汞氯化汞作为休眠种子的灭菌剂最为理想，适用浓度为0.1%，灭菌时间一般为2~10min，用于有较厚种皮的休眠种子灭菌时，可延长到20min或更长时间。MS、N6、B6、LS、RM-1964、B5、White等。MS培养基是Murashige（穆拉希吉）和Skoog（斯科格）于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。B5含有较低的盐离子，这个成分可能对很多培养物的生长有抑制作用。White的无机盐含量较低，适于生根培养。（（11）、）、需要需要大量大量无机盐无机盐（（22））、需要、需要碳碳源源（（33）、）、需要需要植物生长调节剂植物生长调节剂（（44））、需要、需要有机氮源有机氮源（（55））、需要、需要维生素维生素根据无机离子在细胞内的作用分为四大类：根据无机离子在细胞内的作用分为四大类：11、大分子的结构成分：主要是、大分子的结构成分：主要是CC、、HH、、OO、、NN、、PP、、SS等；22、各种酶反应所需的主要离子，包括、各种酶反应所需的主要离子，包括CaCa、、CuCu、、MgMg、、NaNa、、ClCl等等；；33、各种酶活性所需的基础微量半岛体育官方网站登录入口元素，包括：、各种酶活性所需的基础微量元素，包括：CoCo、、CuCu、、FeFe、、MnMn、、ZnZn44、某些生物特殊需要的微量元素，如碘、、某些生物特殊需要的微量元素，如碘、大量元素：大量元素：使用使用浓度浓度大于大于30mg/L30mg/L的无机元素的无机元素包括包括NN、、PK、、MgM半岛体育官方网站登录入口g、、CaCa、、ClCl和和NaNa微量元素：微量元素：使用浓度使用浓度低于低于30mg/L30mg/L的无机元素、的无机元素、如如FeFe、、BB、、MnMn、、II、、MoMo（钼），（钼），以及极微量以及极微量的的CuCu和和ZnZn。某些情况下，还可加入。某些情况下，还可加入NiNi、、CoCo或或AlAl常使用的碳源：糖类、肌醇有时也用甘油等物质代替植物生长调节剂植物生长调节剂：是用于调节植物生长发育的一类药剂，包括人工合成的具有天然植物激素相似作用的化合物和从生物中提取的天然植物激素。到目前到目前为止，已发现植物组织中可以形成为止，已发现植物组织中可以形成55种种植物激素：植物激素：生长素（最早被发现的植物激素）生长素（最早被发现的植物激素）分裂素分裂素赤霉素赤霉素脱落酸脱落酸乙烯乙烯生长素：生长素：用来诱导细胞的分裂、愈伤组织形成和根的分化。用来诱导细胞的分裂、愈伤组织形成和根的分化。组织培养中常用的生长素有：组织培养中常用的生长素有：吲哚吲哚乙酸（乙酸（IAAIAA）：第一个被发现的内源激素，）：第一个被发现的内源激素，是最先被人工合成的生长调节剂是最先被人工合成的生长调节剂二氯苯氧二氯苯氧乙酸（乙酸（2,42,4--DD））萘萘乙酸（乙酸（NAANAA））吲哚吲哚--33--丁酸（丁酸（IBAIBA））萘氧乙酸（乙酸（NOANOA））对氯甲苯对氯甲苯乙酸（乙酸（PP--CPACPA））NAANAA、、IAAIAA、、IBAIBA易引起生根易引起生根2,42,4--DD有利于愈伤组织的诱导和生长有利于愈伤组织的诱导和生长细胞分裂素：细胞分裂素：主要促进细胞分裂和愈伤组织上或器官主要促进细胞分裂和愈伤组织上或器官上分化不定芽。化不定芽。常用常用的的有：66--苄（苄（binbin）基嘌呤（）基嘌呤（BAPBAP）） 66--苄基腺嘌呤（ 苄基腺嘌呤（66--BA BA）） 激动素（呋喃氨基嘌呤、 激动素（呋喃氨基嘌呤、Kinetin Kinetin、、KT KT）） 玉米素（ 玉米素（zeatin zeatin、、zt zt）） 异戊稀氨基嘌呤（稀氨基嘌呤（22--ip ip）） 高浓度生长素和低浓度生长素分裂素 高浓度生长素和低浓度生长素分裂素 刺激 刺激细胞 细胞分裂 分裂 低浓度 低浓度生长素 生长素和高浓度 和高浓度生长素分裂素 生长素分裂素 刺激 刺激细胞 细胞生长 生长 但是，过量赤霉素和酚类化合物能掩盖上但是，过量赤霉素和酚类化合物能掩盖上 述现象。 述现象。 有机氮源为蛋白质水解产物（如谷氨酰胺） 有机氮源为蛋白质水解产物（如谷氨酰胺） 或各种氨基酸。 或各种氨基酸。 对细胞早期生长有利 对细胞早期生长有利 氨基酸 氨基酸的的加入主要是为了代替或增加氮源的 加入主要是为了代替或增加氮源的 供应 供应 苏氨酸、甘氨酸和 苏氨酸、甘氨酸和缬氨酸 缬氨酸，，通过灭活位于叶 通过灭活位于叶 绿体和细胞质上的谷氨酸合成酶而降低氮的利 绿体和细胞质上的谷氨酸合成酶而降低氮的利 用用 精氨酸通常具有补偿此灭活作用的能力。 精氨酸通常具有补偿此灭活作用的能力。 培养基必须加入 培养基必须加入BB族维生素（ 族维生素（B1 B1、、B6 B6和泛酸） 和泛酸） 还还需需加入一定量的生物素和肌醇（是构成磷 加入一定量的生物素和肌醇（是构成磷 酸肌醇【【细胞膜脂质部分含磷酸肌醇细胞膜脂质部分含磷酸肌醇2%~8% 2%~8%】】 极性端的组分） 极性端的组分） 植物细胞/组织培养方法分类： 原生质体培养 单倍体细胞培养固体培养 液体培养悬浮细胞培养 定义： 定义： 利用 利用琼脂作为支持物的固体培养和固定化细胞培养 琼脂作为支持物的固体培养和固定化细胞培养 特点： 特点： 简便易行、培养所占空间小 简便易行、培养所占空间小 常用的固化剂： 常用的固化剂： 琼脂、藻酸盐、角叉藻聚糖、明胶、羟乙基纤维素、 琼脂、藻酸盐、角叉藻聚糖、明胶、羟乙基纤维素、 聚丙烯酰胺、淀粉、硅胶 聚丙烯酰胺、淀粉、硅胶 定义： 把细胞或生物体的一部分，置于液体培养基中使其 发育，并不断振荡，使之均匀地在悬浊液中进行培 养的一种方法。 液体培养系统包括： 小规模的悬浮培养； 大规模的成批培养； 半连续培养； 连续培养。 悬浮培养指的是一种在受到不断搅动或 摇动的液体培养基里，培养单细胞及小细胞 团的组织培养系统，是非贴壁依赖性细胞的 一种培养方式。 悬浮培养可分为 将愈伤组织培养在一定容积的密闭容器中，最后一次收获的培养方式。 成批培养特点： 培养基体积固定培养过程中，细胞生长，其 数目不断发 生变化，呈S增长。 成批培养意义： 它是进行细胞生长和细胞分裂的生理 生化研 究常用的培养方法。 但要进行下一批培养，则生长一定时间后， 需要继代转移。 在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培 养方法 将愈伤组织培养在一个恒定溶剂的流动系统中，以使培养系统中的细胞数量和营养 状态保持稳定。 流动系统：一方面以一定速率不断地加入新的培养基，另一方面又以相同的速率流 出培养物 连续培养意义： 植物细胞代谢调节的研究(某种生长限 度-细胞生长的影响);次生物质的大量生产。 采用的固定化反应器有网状多孔板、尼龙网套和中孔纤维膜等多种类型 固定化培养法 细胞位置固定， 易于获得高密度细胞群体及维持细胞间物 理化学梯度； 利于细胞组织化， 易于控制培养条件及获得较高含量的次级 代谢产物。